Plateformes LBPA
Plateforme de biophotonique et d’imagerie cellulaire
Mots clés : Fluorescence résolue en temps, durées de vie, anisotropie-temps de corrélation rotationnels – Spectroscopie de corrélation (croisée) de fluorescence (FCS & FCCS) – Microscopies confocale & multiphotonique – Photoactivation multiphotonique – FLIM (imagerie en temps de vie de fluorescence) – FRET – TIRF
Objectifs
Son objectif principal est le développement d'outils physique pour l'exploration par imagerie quantitative de milieux moléculaires, macromoléculaires et hybrides pour la chimie, la photo-chimie/biologie, la nanophysique et la biologie.
Les principales applications concernent :
- l’étude de la taille des édifices moléculaires pour notamment identifier le statut oligomérique des protéines (par analyse de l’émission de fluorescence en mode polarisé),
- l’étude des interactions macromoléculaires in vitro et in cellulo (expériences de co-localisations, FRET-FLIM, FCCS...)
- la photoactivation de composés chimiques ou nanoparticules sous excitation NIR/multiphotonique pour déclencher des phénomènes à l’échelle subcellulaire (apoptose, synthèse de NO, relargage contrôlé d’ADN antisens ou Si-ARN...).
Biophotonique - fluorescence résolue en temps
La composante biophotonique met à disposition des méthodes instrumentales pour l'étude in vitro de molécules organiques ou biomolécules (protéine, ADN...) en mesurant les variations temporelles des signaux d'émission de fluorescence.
Mesures de fluorescence résolue en temps
Il permet l'acquisition du signal d'émission de fluorescence résolue en temps par comptage de photons uniques. L'analyse des déclins de fluorescence par maximum d'entropie1 donne accès aux valeurs de temps de vie de fluorescence. La mesure du déclin d'intensité de fluorescence renseigne sur la valeur de temps de vie de fluorescence qui peut être comprise entre 1 et ~20 ns pour la grande majorité des fluorophores conventionnels. Ces déclins peuvent être mono ou multi exponentiels et les mesures de temps de vie renseignent sur l'environnement immédiats des fluorophores.
En mode lumière polarisée, l'analyse des déclins d'anisotropie de fluorescence permet de déterminer les temps de corrélation de rotation reliés aux volumes hydrodynamiques des molécules permettant notamment d'appréhender l'état oligomérique des protéines2. En effet, lorsque la source lumineuse d'excitation est polarisée, une conséquence du principe de photoselection sera de sélectionner une sous-population anisotrope de molécules excitées. Les mouvements de rotation qui animent les molécules entre le temps d'excitation et le temps d'émission sont à l'origine d'une dépolarisation du signal d'émission de fluorescence. Les mesures de déclins d'anisotropie renseignent alors sur la taille des édifices moléculaires en solution via la détermination des temps de corrélation (longs) de rotation qui sont liés au volume hydrodynamique par la célèbre relation de Stokes-Einstein. Comme pour les temps de vie, les déclins d'anisotropie de fluorescence sont souvent complexes - i.e. multiexponentiels - et les temps de corrélation courts, quant à eux, apportent des informations sur la dynamique locale et rapide des fluorophores.
Spectroscopie de corrélation de fluorescence
Il permet de réaliser des expériences de spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) permettant d'étudier la diffusion de translation des fluorophores ou des molécules couplées à des fluorophores2C. Le mode de corrélation croisée de fluorescence (FCCS), à deux couleurs, permet d'appréhender l'interaction de deux partenaires (pour lesquels l'émission de fluorescence est spectralement distincte) ou leur séparation physique par catalyse comme c'est le cas par exemple pour la séparation des deux brins de la double hélice d'ADN par les hélicases3.
La FCS est une méthode de mesure hydrodynamique, au même titre que l’anisotropie résolue en temps. Alors que cette dernière mesure la diffusion moléculaire de rotation, la FCS mesure la diffusion de translation de molécules fluorescentes qui diffusent librement à travers un petit volume d'observation. La diffusion de translation est alors appréhendée par l'analyse temporelle des fluctuations d'intensité de fluorescence qui correspondent aux « entrées-sorties » des espèces moléculaires diluées à travers le volume. Ce volume peut être compris entre 0.2 et 1 fl, il est généré soit par le "pinhole" d'un microscope confocal sous excitation un photon, soit par une excitation deux photons intrinsèquement confinée (c'est le cas du montage de la plateforme). Les fluctuations d'intensités ne sont perceptibles que pour des solutions très diluées, de l'ordre du nM, correspondant à un nombre très réduit de molécules se trouvant en moyenne et simultanément dans le volume d'observation. L'analyse des fluctuations d'intensité par la fonction d'autocorrélation permet de connaître le temps de résidence moyen tau(D) des molécules dans le volume d'observation. La constante de diffusion de translation est alors calculée après estimation des paramètres géométriques qui définissent le volume. L'amplitude initiale de la fonction d'autocorrélation renseigne quant à elle sur la concentration de l’échantillon.
La FCCS permet de contourner le problème de sensibilité au changement de taille qui peut être rencontré en FCS. La FCCS permet de mesurer la corrélation croisée des fluctuations de fluorescence de deux espèces moléculaires d'intérêt, chacune marquée par un fluorophore spectralement distinct. Un montage expérimental de FCCS est très semblable à un montage de FCS, à ceci près qu'il nécessite 2 détecteurs combinés à 2 sources d'excitation, même si plusieurs montages expérimentaux dont celui du LBPA sont basés sur une unique source d'excitation deux photons. Cette approche permet alors de quantifier le degré de concomitance de diffusion des deux espèces à travers le volume d'observation, et donc d'estimer la quantité d'espèces en interaction, i.e. doublement fluorescentes, en se référant à l'amplitude de la fonction de corrélation croisée. Contrairement au transfert résonnant d'énergie (FRET) dont le signal dépend fortement de la distance entre les deux marqueurs (appelés respectivement donneur et accepteur) et de leur orientation respective, le signal FCCS ne tient pas compte dans l'absolue de notion de distance entre les deux marqueurs.
Equipements associés
Un laser infra-rouge (IR) pulsé fs Mai Tai (Spectra Physics) accordable en longueur d'onde (690-1020nm, 10W) est associé à ces deux dispositifs. Associé à un pulse picker et un cristal doubleur (430-510 nm)-tripleur (280-310 nm) de fréquence (générateur 2nde/3ème harmonique) (Spectra Physics) pour l'étude des fluorophores émettant dans le visible ou l'UV, il est utilisé pour les expériences de fluorescence résolues en temps (mesures des temps de vie et déclins d'anisotropie) (détecteur MCP-PMT Hamatsu R3809U-05 et carte de comptage TCSPC Becker & Hikl SPC-730).
Dans le mode IR, il permet directement l'excitation biphotonique pour les expériences de FC(C)S. Il est alors couplé à un microscope inversé (Nikon TE2000), 1 détecteur (FCS) ou 2 détecteurs (FCCS) type-photodiodes à avalanche (Perkin Elmer, SPCM-AQR-14), et un corrélateur digital (ALV6000) permettant les calculs des fonctions d'autocorrélation et de corrélation croisée. Le même laser est utilisé pour la détermination des sections efficaces d'absorption deux photons (Sigma2).
Pour les études de fluorescence en mode statique, la plateforme est équipée d'un spectrofluorimètre (Eclipse, Varian) compatible avec le mode polarisation et d'un appareil PanVera dédié aux mesures de polarisation. Elle est également équipée d’un appareil VictorV (Perkin Elmer) pour les mesures d’intensité et d’anisotropie de fluorescence sur plaques 96 puits et d’un appareil DLS (dynamic ligth scattering) (DynaPro Wyatt).
Imagerie cellulaire
La composante imagerie cellulaire permet l'observation de phénomènes biologiques et biophysiques, intra et intercellulaires. Elle comprend deux microscopes confocaux Leica et un microscope Zeiss AxioObserver avec un module TIRF (total internal reflection fluorescence).
Le poste de microscopie confocale Leica SP2
Il est équipé d'un contrôle en température et en CO2 qui permet l'observation de cellules vivantes. Différentes longueurs d'ondes d'excitation sont disponibles : 458, 476, 488, 514, 543 et 633 nm. Des expériences de FLIM (imagerie par temps de vie de fluorescence) se font grâce à une carte d'acquisition SPC830 couplée à un détecteur PMC 100 (Becker Hickl). Un laser IR pulsé fs Mai Tai accordable (Spectra Physics) permet une excitation bi-photonique. Plusieurs détecteurs sont disponibles : 3 détecteurs analogiques et 1 en comptage de photon unique. 3 grossissements sont possibles : 10x, 63x et 100x. Les mesures par temps de vie de fluorescence permettent également d'appréhender les interactions moléculaires in cellulo par FRET (Förster resonance energy transfer).
Le couplage avec le laser pulsé permet également d'appréhender la photoactivation par excitation multiphotonique (dans le proche infra-rouge) de processus biologiques comme par exemple le déclenchement photo-contrôlé (i) du transfert d'électron au niveau de la NO-synthase en ciblant cette dernière par des dérivés du NADPH photoactivables4 ou bien encore (ii) du processus d'apoptose par des composés ciblant les mitochondries5. Dans les deux cas, les composés photoactivables sont caractérisés par de très bonnes sections efficaces d'absorption deux photons.
Le poste de microscopie confocale Leica SP8
Il est équipé de deux détecteurs analogiques et d'un détecteur de type Hybride permettant des mesures quantitatives. Les longueurs d'ondes disponibles sont 405, 458, 488, 514, 561 et 633 nm qui permettent l'excitation de nombreux fluorophores. Trois grossissements sont possibles : 10x 63x et 100x.
Le microscope Zeiss AxioObserver
Il est muni d'un module TIRF. Cette microscopie de haute résolution permet l'observation dynamique de phénomènes rapides en faible profondeur (environ 200 nm). Une camera EMCCD Evolve 512 permet une acquisition très rapide ( > 100 images par seconde). Deux diodes lasers permettent l'excitation des fluorophores les plus courants, 450 et 560 nm.
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