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ENS Cachan - Laboratoire de biologie et de pharmacologie appliquée (LBPA)

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Biophotonique et études par fluorescence résolue en temps

La plateforme biophotonique met à disposition des méthodes instrumentales pour l'étude de molécules organiques ou biomolécules (protéine, ADN...) en mesurant les variations temporelles des signaux d'émission de fluorescence. Le premier dispositif permet l'acquisition du signal d'émission de fluorescence résolue en temps par comptage de photons uniques. L'analyse des déclins de fluorescence par maximum d'entropie (1,2) donne accès aux valeurs de temps de vie de fluorescence caractéristiques des fluorophores étudiés.

En mode lumière polarisée, l'analyse des déclins d'anisotropie de fluorescence permet de déterminer les temps de corrélation de rotation reliés aux volumes hydrodynamiques des molécules permettant notamment d'appréhender l'état oligomérique des protéines (1-3).


Le deuxième dispositif permet de réaliser des expériences de spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) permettant d'étudier la diffusion de translation des fluorophores ou des molécules couplées à des fluorophores (2). Le mode de corrélation croisée de fluorescence (FCCS), à deux couleurs, permet d'appréhender l'interaction de deux partenaires (pour lesquels l'émission de fluorescence est spectralement distincte) ou leur séparation physique par catalyse comme c'est le cas par exemple pour la séparation des deux brins de la double hélice d'ADN par les hélicases (4) (figure).

 Un laser infra rouge (IR) pulsé femtoseconde Mai Tai (Spectra Physics) accordable en longueur d'onde (690-1020nm, 10W) est associé à ces deux montages expérimentaux (1). Associé à un pulse picker et un cristal doubleur-tripleur de fréquence (Spectra Physics) pour l'étude des fluorophores émettant dans le visible ou l'UV (ex: tryptophanes), il est utilisé pour les expériences de fluorescence résolues en temps (mesures des temps de vie et déclins d'anisotropie) (2). Dans le mode IR, il permet l'excitation biphotonique pour les expériences de FCS et FCCS. Il est alors couplé à un microscope inversé (Nikon TE2000), 1 détecteur (FCS) ou 2 détecteurs (FCCS) type-photodiodes à avalanche (Perkin Elmer, SPCM-AQR-14), et un corrélateur digital (ALV6000) permettant les calculs des fonctions d'autocorrélation et de corrélation croisée. Le même laser peut être utilisé pour la détermination des sections efficaces d'absorption deux photons de composés chimiques (5,6).

1. Henry E., Deprez E. & Brochon JC. Maximum entropy analysis of data simulations and practical aspects of time-resolved fluorescence measurements in the study of molecular interactions. J. Mol. Struct. (2014) 1077, 77-86.

2. Deprez E., Tauc P., Leh H., Mouscadet JF., Auclair C., Hawkins M. E. & Brochon JC. DNA binding induces dissociation of the multimeric form of HIV-1 integrase: a time-resolved fluorescence anisotropy study. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A (2001) 98, 10090-95.

3. Delelis O., Carayon K., Guiot E., Leh H., Tauc P., Brochon J-C., Mouscadet JF. & Deprez E. Insight into the integrase-DNA recognition mechanism: A specific DNA-binding mode revealed by an enzymatically labeled integrase J. Biol. Chem. (2008) 283, 27838-49.

4. Li N., Henry E., Guiot E., Rigolet P., Brochon J-C., Xi XG. & Deprez E. Multiple E. coli helicase monomers cooperate to unwind long DNA substrates: A fluorescence cross-correlation spectroscopy study. J. Biol. Chem. (2010) 285, 6922-6936.

5. Chennoufi R., Bougherara H., Gagey-Eilstein N., Dumat B., Henry H., Subra F., Bury-Moné S., Mahuteau-Betzer F., Tauc P., Teulade-Fichou MP. & Deprez E. Mitochondria-targeted Triphenylamine Derivatives Activatable by Two-Photon Excitation for Triggering and Imaging Cell Apoptosis. Sci. Rep. (2016) 6:21458.

6. Li Y., Wang H., Tarus B., Romero Perez M., Morellato L., Henry E., Berka V., Tsai A.L., Ramassamy B., Dhimane H., Dessy C., Tauc P., Boucher J-L., Deprez E., Slama-Schwok A. Rational design of a fluorescent NADPH derivative imaging constitutive nitric-oxide synthases upon two-photon excitation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A (2012) 109, 12526-31.

 



Liste des équipements :

  • Laser Spectra Physics Mai Tai (690-1020 nm)
  • Pulse Picker et doubleur-tripleur de fréquence (générateur 2nde/3ème harmonique) Spectra Physics
  • Microscope Nikon TE2000 inversé avec objectif 100X
  • Corrélateur ALV6000